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长井雅乐在文久三年（1863年）二月切腹自杀，从此长州藩论全面转向尊王攘夷，并最终发动兵马上洛，酿成了血腥的“禁门之变”。
且说长州军总计三千人，分海陆两道杀往大坂，随即以伏见的长州藩邸为据点，大举向京都进发。当时守卫京都的是包括萨摩、会津在内的共三十个藩的部队，就兵力来说，长州军完全落在下风。然而被热血冲昏了头脑的长州激进尊攘派却根本看不清形势，在他们想来，只要通过公卿上奏天皇，说明自己的尊攘大义，则天皇自然会站到自己一边，到了那个时候，萨摩、会津等藩的武士，难道还敢违逆天皇的旨意吗？
然而事实上当时的孝明天皇并无从幕府手中收归权力的野心，同时因为去年几场失败的攘夷战争，也已经很明确地表过态：“征服丑夷乃国家之大典……无谋之攘夷实不为朕之所望……”所以天皇是根本不会主动走出皇宫，接纳长州志士们的所谓忠心的。
皇宫四周布列着各藩军队，而长州军则分扎在嵯峨天龙寺、山崎天王山和伏见三处，与各藩遥遥相对。六月二十七日，松平容保命令各藩部队加强皇宫各门的警备，勿使长州一人一骑进入。七月三日，他又写信给福原越后，要求长州军尽快撤出京都附近地区，否则后果自负。
长州军不甘心就此退出洛中，可是面对数倍于己的兵力，也不敢贸然发动攻击。就这样，随着时间的流逝，形势对幕府方越来越有利，七月十八日夜晚，松平容保终于请到了幕府讨伐长州的敕命，随即带病出阵，指挥各藩军队向长州军发起猛攻。
长州军得到消息后，骑虎难下，被迫分道杀向皇宫，激烈的战斗就这样打响了。山崎方面屯扎着长州军的主力，主要将领有久坂玄瑞、益田右卫门介、真木和泉等人，首先遭到诸藩联军的进攻，被迫向后退却。为了掩护主力部队，同时扭转战场形势，另外两路长州军大踏步地向皇宫挺进，先锋来岛又兵卫亲率两百名部下直冲向蛤御门。
当时守备蛤御门的乃是八百名会津藩兵，看到长州军汹涌杀来，匆忙奋起迎战，双方就此在御门前展开了激斗。作为天龙寺方面主将的国司信浓紧跟在来岛又兵卫之后加入战团，高呼“杀败会奸，冲进皇宫去求见天皇陛下”等口号拼死奋战，会津军力不能敌，节节败退，眼看御门就要被长州军攻破了。
然而就在这个时候，一直驻扎在附近、守护乾御门的萨摩岛津军却开始行动了。岛津方主将正是前几年投海不死的西乡吉之助隆盛，在他的指挥下，两百余名萨摩藩兵救援蛤御门，奇Qīsuū。сom书突然出现在长州军的背后。遭到前后夹击的长州军瞬间崩溃，素有“鬼来岛”之称的勇士来岛又兵卫身中铳弹，自度不得幸免，于是含恨切腹而死。
就这样，长州军最后一线转败为胜的希望就此破灭，三路军队陆续都被击溃。久坂玄瑞被迫闯入公卿鹰司邸，想要负隅顽抗，结果被萨摩、会津、桑名等藩兵团团围住。恶战一场后，玄瑞和好友寺岛忠三郎一起含泪对刺而死。
最后毙命的长州军大将是真木和泉，他依靠天王山地势之险，一直固守到八月二十一日，掩护三位家老顺利撤退，然后也被迫自尽了。这就是著名的“蛤御门之变”，也称“禁门之变”，长州藩第一次明确地打出尊王倒幕的旗帜，但因为准备不够充分，敌我力量对比过于悬殊，最终以全面溃败而告终。据说经此一战，长州藩尊攘志士战死达三百余人，藩中舆论为之大变。
●功山寺起义
“禁门之变”爆发后，幕府传令各地诸侯，以前尾张藩主德川庆胜为总督，越前藩主松平茂昭为副将，联军讨伐长州。然而此时幕府权威已堕，诸侯各抱观望之心，都不肯使出全力，担任讨伐军总参谋的萨摩重臣西乡吉之助遂提出一计，要“以长州人来处置长州人”——这一计划取得了完美的成功。
且说讨伐军是元治元年（1864年）八月二日出动的，然而还没等走到长州，八月五日，英、美、法、荷四国联合舰队驶入关门海峡，对长州重镇下关展开了猛烈的炮击——这是对去年长州藩攻击美、法等国船只而采取的报复行动。于是藩内保守派椋梨藤太等人趁机向毛利敬亲提出，只有排斥尊攘派，并且立刻向幕府谢罪，“纯一恭顺”，才能挽救毛利家濒临灭亡的命运。
在这些保守派，也被称为“俗论派”的打击下，周布政之助被迫自杀，激进攘夷派的代表井上闻多（馨）遭到保守的“选锋队”的袭击，伤重而遁。于是毛利敬亲勒令益田右卫门介、国司信浓、福原越后三家老自尽，同时破弃重镇山口城，交出落难的五位公卿（七卿或死或走，留在长州的还有五个），亲笔写信向幕府谢罪，用这些屈辱的条件劝退了讨伐军。
这就是第一次“征长之战”，在西乡吉之助的谋划下，长州藩不战而败，藩内尊攘势力几乎被扫荡一空。然后，就该轮到狂飙突进的高杉晋作出场了。
与绝大多数尊攘志士不同，高杉晋作出身于一个中上级武士家庭。因为高杉氏的家纹为“丸之四割菱”，所以有传说出自甲斐武田氏，先祖是战国时代的备后国高杉城主武田小四郎春时。晋作的父亲高杉小忠太领二百石俸禄，就其在长州藩内的身份来说，可比德川幕府的旗本。晋作初名和介，自小聪颖，在藩校“明伦馆”中取得了优异成绩，得到毛利敬亲、定广父子的称赞。
当时在“明伦馆”中还有一个高材生，同时也是高杉晋作的好友，那就是久坂玄瑞，经过玄瑞的介绍，晋作与其同时投拜在吉田松阴门下——照理说，松下村塾所招收的大多是中下级武士学生，晋作本来是不可能想到要去那样一个乡下学校进修的。
在村下村塾的日子里，高杉晋作受到吉田松阴深刻的影响，同时他还四处游历，先后向思想家佐久间象山、横井小楠等人求教，思想倾向逐渐转变为尊王攘夷。而因为他的学习成绩良好，遂被与久坂玄瑞，入江久一并称为“松下三高足”。
文久元年（1861年），晋作被选为世嗣毛利定广的小姓役，也就是青年侍卫官，随即他获得许可，乘坐木船“千岁丸”渡海前往上海考察和学习。此时正值太平天国运动席卷中国东南半壁，西方列强协助清政府镇压这次运动，从而更进一步地把中国半殖民地化，上海是全中国苦难的最鲜明的缩影。在上海的这段日子里，晋作的思想开始发生转化，一方面产生严重的危机感，深知日本若不革新自强，结果必将比清朝更惨，另方面，他的对外倾向也逐渐转向开国。
回藩后，高杉晋作提出“大割据”策略，想要以长州藩为基地率先进行改革，从而逐渐向外影响整个日本。在他的建议下，毛利敬亲答应组建一支“奇兵队”，和旧有的藩兵不同，这支部队不论出身，其中既有武士，也有很多商人、城市平民和农民的子弟。高杉晋作成为“奇兵队”的总督，自号东行，毛利敬亲则名其为东一（东邦第一人）和谷潜藏（深谷潜龙）。
受到“奇兵队”的影响，长州藩内各种半军事性组织逐一被建立了起来，比如前面提到过的来岛右兵卫的“游击队”，以及伊藤俊辅（博文）的“力士队”、吉富藤兵卫的“鸣城队”、品川弥次郎的“御楯队”，还有“荻野队”、“膺惩队”、“第二奇兵队”，等等。其中就人数和军事实力来说，当然以“奇兵队”为其翘楚，落难长州的公卿三条实美就曾经欣然为“奇兵队”题词道：“忠义填骨髓”。
对于长州藩兵上洛申诉的鲁莽行动，高杉晋作持鲜明的反对态度，甚至不惜脱藩下狱，而他的好友久坂玄瑞虽然也表示反对，但态度不够坚决，最终被胁裹前往，血洒鹰司藩邸。消息传来，晋作悲恸不已，为了抵挡幕府军的攻击，挽救长州藩的危亡，他提出“武力恭顺”的主张，也即阳奉阴违，表面上向幕府低头，实际却秣兵厉马，寻机再举。
然而“武力恭顺”被“纯一恭顺”压倒，俗论派趁机上了台，开始残酷地镇压尊攘志士，晋作也被迫亡命北九州。元治元年（1864年）十二月，幕府军还没有退尽，他就悄悄地潜回了长州，前往下关去会见“松下村塾”的同学山县狂介，商讨起义计划。